Взаимодействия штаммов Trichoderma с растениями и резистентность к патогенам

Виды рода Trichoderma способны защищать растения от действия патогенов с помощью подавления фитопатогенных микроорганизмов, а также путем индуцирования системной и локальной резистентности растений. Такие прямые эффекты Trichoderma на рост и развитие растений очень важны для применения в сельском хозяйстве и для понимания роли грибов Trichoderma в природных и искусственных экосистемах.

Штаммы Trichoderma способны колонизировать как локальные сайты на корнях, так и все корневые поверхности в случае ризосферокомпетентных штаммов (Harman et al., 2000). Иногда это напоминает морфологический микопаразитизм: гифы проникают через эпидермис корневых клеток (фото). Проникновение обычно ограничивается первым и вторым слоями клеток. Однако описан эндофитный штамм T. stromaticum, обитающий в сосудистой системе растения какао. Инвазия штаммов Trichoderma во внешние слои клеток может привести к развитию системной резистентности растений (СРР), и штамм, колонизирующий сосудистую ткань, может быть более эффективным индуктором (Harman et al., 2004).

Влияние колонизации корней на метаболизм растения

В некоторых работах показано, что колонизация корней видами Trichoderma приводит к увеличению уровня защитных ферментов растений, в том числе пероксидаз, хитиназ, β-1,3-глюканаз и фермента липоксигеназного пути гидроксипероксид лиазы (Howell et al., 2000). Так, внесение штамма Т-203 T. asperellum под огурцы приводило к постоянному увеличению синтеза фенилаланин-аммиаклиазы в проростках и корнях, но через 2 дня эффект исчезал. Однако если на листья наносили инокулят патогена Pseudomonas syringae pv. lachrymans, экспрессия генов защитных белков продолжалась длительное время.

Изменения метаболизма растения может приводить к аккумуляции антимикробных веществ. Способность T. virens индуцировать синтез фитоалексинов и индуцировать локальную резистентность в хлопчатнике является предметом дискуссии. Колонизация корней огурцов штаммом Т-203 приводила к увеличению уровня фенолглюкозида в листьях. Агликоны (фенолглюкозиды без одного углеводного остатка) являются сильными ингибиторами разных бактерий и грибов. Накопление ингибиторов наблюдается только в тех растениях, в корневую зону которых инокулировали штамм Т-203, и листья которых затем заразили Pseudomonas syringae pv. lachrymans. Эффект не наблюдался, если какой-нибудь из штаммов вносился в систему один. Эффект не зависел только от штамма Т-203. Анализ экстрактов листьев показал, что больше антимикробных веществ накапливалось в тех листьях, на которые наносили инокулят штаммов Р1 и Т-22. Таким образом, виды Trichoderma не только непосредственно выделяют антибиотики, но и стимулируют образование антимикробных соединений в растениях.
Колонизация корней этими грибами, таким образом, вызывает значительные изменения растительного метаболизма.

Улучшение корневой системы и роста растений

Виды Trichoderma и другие полезные колонизирующие корни микроорганизмы улучшают рост растений и увеличивают урожайность культур, но долговременное улучшение могут вызывать только ризосферокомпетентные штаммы. В тепличном растениеводстве штамм Т-22 T. harzianum широко используется для защиты от болезней растений вместо химических фунгицидов, поскольку он безопасен для работников. Эффект биоконтрольного агента сохраняется дольше, чем эффект пестицидов, препарат дешевле пестицидов, препарат, в отличие от пестицидов, улучшал состояние корневой системы растений (Harman et al., 2000).

Улучшение развития корневой системы и ускорение роста

В лабораторных опытах и многочисленных полевых испытаниях штамма Т-22 показано, что Т-22 улучшал развитие корневой системы у растений кукурузы и у других культур (фото). Этот эффект сохранялся в течение всей жизни однолетнего растения, а вызвать эффект можно было путем протравливания семян из расчета 1 г биомассы на 1 га. Например, кукурузу выращивали из семян, обработанных Т-22 и не обработанных. Несколько месяцев спустя, растения выросли до 2 м. Колонизация корней штаммом Т-22 привела к развитию вторичных корней уже на глубине 25-75 см от поверхности почвы. Количество вторичных корней в опыте превышало контрольные показатели в 2 раза. В результате растения были устойчивее к засухе, и, возможно, приобрели устойчивость к уплотнению почвы (Harman et al., 2000). Не только штамм Т-22 и другие Trichoderma способны улучшать развитие корневой системы кукурузы и тепличных культур, но и другие полезные колонизирующие корни микроорганизмы также улучшают рост и развитие растений. Доказано существование синергизма между микоризными грибами и Т-22. Также существует синергизм между ферментами Trichoderma и бактериальными антибиотиками (Woo et al., 2002). Более того, смешанная культура нескольких биоконтрольных агентов может быть более эффективна, чем единичный агент.

Повышенное развитие корневой системы часто приводит к повышению урожайности и увеличению биомассы растений. Проведено более чем 500 лабораторных и полевых коммерческих испытаний штамма Т-22 на кукурузе.

Общее увеличение урожайности при использовании в стандартной агрономической практике составило 5%. В процессе опытов часто наблюдали ускорение роста как полевых культур, так и тепличных растений (Harman et al., 2000). Таким образом, применение видов Trichoderma может привести к увеличению урожайности культуры, что особенно важно в неблагоприятных условиях. Главным образом, увеличение урожая наблюдается в стрессовых условиях. Когда современные культуры выращивают в неблагоприятных условиях, мало шансов получить высокий урожай. Однако даже в неблагоприятных условиях протравливание семян кукурузы Т-22 позволило получать высокие урожаи.

Важно разделять прямые воздействия на рост растений, и контроль патогенов и других вредных микроорганизмов, замедляющих рост растений. Однако при взаимодействии Т-22 и растений кукурузы происходило ускорение роста корней и проростков как в стерильной, так и в нестерильной почве, а также в присутствии фунгицидов в почве. Более того, штамм Т-203 T. asperellum и другие штаммы Trichoderma ускоряли рост растений в гидропонной культуре. В большинстве случаев, однако, улучшение развития корней и связанный с этим ускоренный рост растений происходили как в результате биоконтроля патогенов и воздействия полезной ризосферной микрофлоры, так и в результате прямого воздействия грибов на рост растения.

Известно, что вредная корневая микрофлора способна снижать скорость роста растений даже в отсутствие заболеваний. Некоторые вредные корневые микроорганизмы выделяют цианид для сохранения своей экологической ниши и для успешной конкуренции. Виды Trichoderma устойчивы к цианиду и секретируют два фермента, разрушающих цианид в ризосфере (Ezzi, Lynch, 2005). Таким образом, эти грибы способны прямо увеличивать скорость роста растений путем контроля вредных непатогенных корневых микроорганизмов, разрушать токсичные метаболиты и подавлять рост патогенов.

Ускорение роста корней и всего растения под воздействием грибов Trichoderma, устойчивость к стрессу достигается разными путями. Каждый из путей включает в себя несколько механизмов, описанных для большинства патогенов корней и листьев.

Влияние Trichoderma на потребление питательных веществ растениями

Виды Trichoderma увеличивали потребление и концентрацию разнообразных элементов (меди, фосфора, железа, марганца и натрия) корнями растений в гидропонной культуре даже в неблагоприятных условиях (Yedidia et al., 2001). Увеличение потребления свидетельствует о положительном влиянии Trichoderma на интенсивность потребления элементов растениями. Кукуруза реагировала на повышение усвоения азотных удобрений тем, что листья растений становились более зелеными, чем в контроле. Урожайность достигала максимальных показателей и выходила на плато. Значения максимальной урожайности специфичны для каждого генотипа в соответствующих условиях. Однако было показано, что культуры, выращенные из семян, протравленных Т-22, дают максимальные урожаи, хотя под них вносили на 40% меньше азотных удобрений, чем в контроле (Harman et al., 2000). При дополнительной азотной подкормке урожай может превысить значения плато для данной культуры. Результаты показывают, что Т-22 увеличивает эффективность азотного удобрения на кукурузе. Данное обстоятельство позволило сократить нитратное загрязнение почвы и поверхностных вод, что является серьезным побочным отрицательным следствием крупномасштабного производства кукурузы. Как показывают анализы, кроме положительного влияния на усвоение азота, Т-22 значительно увеличивал потребление многих элементов, таких, как мышьяк, кобальт, кадмий, хром, никель, свинец, ванадий, магний, марганец, медь, бор, цинк, алюминий и натрий. В полевых опытах эффект значительно снижался (Harman, 2004).

Наконец, известно, что Т-22 – и, возможно, другие виды Trichoderma – способны переводить в растворимые формы различные питательные для растений элементы, такие, как минеральные фосфаты, Fe3+, Cu2+, Mn4+, Zn0. Эти элементы часто недоступны в почве для растений. Т-22 снижает содержание окисленных ионов металлов, переводит их в подвижные формы, выделяет сидерофоры, хелатирующие ионы. Исследована способность стимуляции роста растения и биоконтроля гриба Trichoderma harzianum Rifai 1295-22 (Т-22) путем растворения in vitro некоторых нерастворимых или недостаточно растворимых минералов (Altomare et al., 1999). Существует три возможных механизма: подкисление среды, продуцирование хелатных метаболитов и окислительная активность. Т-22 был способен к растворению MnO2, металлического цинка и неорганического фосфата (главным образом, фосфата кальция) в жидкой среде, содержащей сахарозно-дрожжевой экстракт. Подкисление не было главным механизмом растворения, так как pH культур никогда не падал ниже 5.0, и в культурах, содержащих MnO2, pH повышался от 6.8 до 7.4. Органические кислоты не были обнаружены. Fe2O3, MnO2, Zn, и неорганический фосфат были растворены. Эта деятельность может объяснять, по крайней мере, частично, способность T-22 к увеличению роста растения. Растворение металлической окиси происходит с участием хелатиона и процесса окисления. Оба из этих механизмов также играют роль в биоконтроле патогенных растений при разнообразных состояниях окружающей среды.

Радриш с соавторами (Rudresh et al., 2005) исследовали эффект комбинированной инокуляции Rhizobium, фосфат растворяющих Bacillus megaterium sub sp phospaticum и биоконтроль Trichoderma в росте, потреблении азота и урожая нута в теплице и в полевых условиях. Комбинированная инокуляция этих трех организмов привела к повышению прорастания, усваивания азота (120 мг/раст.), фосфора (6 мг/раст.), высоты растений, числа ответвлений, образования узелков, урожая, и общей биомассы по сравнению с каждой индивидуальной инокуляцией и не инокулированным контролем.

Выводы о воздействии на рост растений

Для отдельных видов Trichoderma показана способность к увеличению роста и массы корней, что приводит к повышению урожайности. Во многих случаях реакции растений являются результатом прямых воздействий на растения, снижения активности вредной корневой микрофлоры, инактивации токсических метаболитов в корневой зоне. Полезные грибы увеличивают потребление питательных элементов и эффективность усвоения азота, а также солюбилизируют элементы из почвы. Генетическая и молекулярная основа этих эффектов неизвестна. У разных видов и сортов растений наблюдаются отличия в ответных реакциях на воздействие Trichoderma, по крайней мере, это показано для кукурузы (Harman, 2003). Недавно показано, что стимуляция роста растений под воздействием бактерий, фенотипически напоминающая ситуацию с Trichoderma Т-22, связана с тем, что бактерии выделяют летучие вещества, такие, как ацетоин и 2,3-бутанедиол. Молекулярная структура элиситоров, стимулирующих рост растений, Trichoderma spp. неизвестна. Колонизация корней также увеличивает скорость роста корней и всего растения, что приводит к повышению продуктивности культуры и урожая репродуктивных органов. Колонизация корней также помогает растению преодолеть абиотические стрессы и увеличивает усвоение питательных элементов.

Индукция резистентности растений

Резисте́нтность (от лат. resistentia — сопротивление, противодействие) — сопротивляемость (устойчивость, невосприимчивость) организма к воздействию различных факторов — инфекций, ядов, загрязнений, паразитов, и т. п. В частности, « индуцированной резистентностью» называют средства врождённого иммунитета.

Установлено 3 главных пути развития индуцированной резистентности (ИР) в растениях. В двух путях происходит прямое образование белков, связанных с патогенезом (БП). В одной системе БП образуются в результате атаки патогенными микроорганизмами, во второй – в результате повреждения и некроза тканей, вызванного хищниками и патогенами. Например, раны, нанесенные насекомыми. Но оба пути могут индуцироваться в результате атаки другими организмами. В типичном случае в результате функционирования пути, индуцированного патогеном, образуется салициловая кислота как сигнальная молекула. В результате повреждения ткани растения хищником образуется жасмоновая кислота. Эти вещества и их аналоги при экзогенном нанесении на растение также индуцируют резистентность, кроме того, метаболические пути сигнальных молекул связаны между собой. Терминология, связанная с этими процессами, сомнительная и часто отвечает предпочтениям исследователей. Жасмонатный путь определяют как индуцированную системную резистентность. Этим же термином обозначается совершенно иной процесс, инициируемый ризобактериями. Жасмонатный и салицилатный пути характеризуются синтезом каскада БП (Segarra et al., 2006). Это микотоксичные хитиназы, глюканазы и травматины, окислительные ферменты, такие, как пероксидазы, полифенолоксидазы и липоксигеназы. В тканях растений накапливают низкомолекулярные антимикробные вещества (фитоалексины). Триггерные молекулы, образующиеся в ответ на воздействие Trichoderma, неизвестны. В данной главе мы приводим пример системной приобретенной резистентности (СПР), развивающейся в результате накопления БП и фитоалексинов. Третий тип ИР описан для случая невирулентных ризосферных бактерий, как РСРР (ризобактериальная системная резистентность растений). Фенотип РСРР напоминает жасмонатный путь, однако процессы, приводящие к СРР, различны. В отсутствие атаки патогенов колонизация корней ризобактериями не приводит к аккумуляции в тканях растений БП и фитоалексинов. При атаке патогенов растения реагируют более активно, и болезнь подавляется. Так, ризобактерии стимулируют защитные реакции растений в отсутствие каскада ферментов, характерных для жасмонатного и салицилатного пути ИР.

Индукция резистентности растений элиситорами Trichoderma

Данные, приведенные выше, позволяют нам формулировать модельные механизмы, посредством которых виды Trichoderma контролируют или снижают заболеваемость растений. Различные штаммы T. virens, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum вызывают изменения метаболизма растений и увеличивают резистентность растений к широкому набору фитопатогенных микроорганизмов и вирусов.

Более того, защитные ответы этого типа широко распространены и эффективны для многих растений. Так, штамм Т-22 индуцировал устойчивость многих растений от томатов до кукурузы (таблица), что говорит об отсутствии специфичности растений в отношении защитного механизма.

Когда споры или другие пропагулы вносят в почву, где они контактируют с корнями растений, они прорастают и растут на поверхности корней и чаще всего инфицируют внешние клеточные слои. Виды Trichoderma образуют 3 типа элиситоров защитных механизмов растений, которые предотвращают заражение корней фитопатогенами. Элиситорами являются пептиды, белки и низкомолекулярные вещества. В некоторых случаях развивается локальная резистентность, как в случае T. virens на хлопчатнике. Но в большинстве ассоциаций растений с видами Trichoderma развивается системная резистентность. Через короткий период времени происходит экспрессия генов, кодирующих защитные механизмы, по всему растению. Этот эффект может быть проходящим, но патоген сразу инициирует экспрессию защитного механизма в органах, удаленных от сайта обитания биоконтрольного штамма Trichoderma.

Результаты показывают, что начальные реакции защитного механизма напоминают СПР. В случае взаимодействия T. asperellum и растений огурца до атаки фитопатогена наблюдали невысокий уровень защитных белков в растениях. Подобная ситуация наблюдалась в случае ризобактериальной СРР. Виды Trichoderma прямо атакуют другие грибы, выделяют антибиотики и непосредственно убивают или предотвращают развитие патогенных грибов при помощи всех этих механизмов.

Индуцированная ризобактериями СРР фенотипически напоминает СПР. Однако, в отличие от ситуации при СПР, колонизация корней ризобактериями не приводит к экспресии белков, характерных для патогенеза, и колонизация корней некоторыми бактериями также не приводит к индукции и аккумуляции салициловой кислоты в растении.

Вместо этого, растения подготавливаются для того, чтобы быстро реагировать на атаку патогенов. В растении Arabidopsis СРР, индуцированная ризобактериями, приводит к повышению чувствительности к жасмоновой кислоте и этилену, и как в случае СПР, зависит от фактора транскрипции NPR 1.

Индукция СРР видами Trichoderma изучена недостаточно по сравнению с ризобактериальной СРР, поскольку в случае Trichoderma основное внимание ученых уделялось прямым воздействиям на другие грибы, особенно микопаразитизму и антибиозу. Возможно, что работа Биграймана с соавторами, опубликованная в 1997 го- ду (цит. по Harman et al., 2004), была первой работой, в которой было приведено документальное свидетельство СРР, индуцированной Trichoderma.

Авторы показали, что внесение в почву под бобы штамма Т-39 T. harzianum приводило к тому, что листья бобов были устойчивы к таким патогенам, как B. cinerea и Colletotrichum lindemuthianum, хотя штамм Т-39 присутствовал на корнях, но не листьях растений. Эта же группа авторов изучала СРР к B. cinerea у других двудольных растений. Похожие испытания проведены на значительном спектре однодольных и двудольных растений с использованием различных видов и штаммов рода Trichoderma (таблица).

Способность штамма Т-22 T. harzianum индуцировать СР у растений кукурузы против различных патогенов не вызывает сомнений. Однако нет пока похожих данных о способности микроорганизмов комменсалов или симбионтов растений, обитающих на корнях, индуцировать СРР на других культурах. Таким образом, способность индуцировать СРР против широкого спектра патогенов (грибов, бактерий и вирусов) у разных растений, по-видимому, присуща всем представителям рода Trichoderma (таблица). Однако остается еще много неясного в механизмах индукции.

Большинство примеров СРР в таблице показывает, что это именно системная устойчивость, поскольку все штаммы Trichoderma присутствуют только на корнях, но не на листьях.

Труднее изучать примеры индукции устойчивости к патогенам, которые вызывают заболевания корней или семян, особенно в тех случаях, когда биоконтрольный агент и патоген локализованы в одном и том же сайте. Однако установлено, что штаммы T. virens различались по способности синтезировать антибиотики или являться микопаразитами (Howell et al., 2000).

Мутантные и дикие штаммы были проверены на способность контролировать заболевания саженцев хлопчатника, которые вызывает Rhizoctonia solani. Однако ни способность синтезировать антибиотики, ни микопаразитизм не были тесно связаны с эффективностью биоконтроля. А вот способность штаммов индуцировать синтез терпеноидов фитоалексинов в растении строго коррелировала с активностью биоконтроля.

Прямые воздействия на фитопатогены являются только одним из механизмов биоконтроля и, возможно, являются менее важными, чем индукция СРР. В этом случае штаммы T. virens, похоже, индуцировали скорее локальную, чем системную резистентность (Howell, 2003). Однако большинство других штаммов, указанных в таблице, индуцировали СРР разных культур.

Интересным является тот факт, что индуцированная резистентность – по крайней мере, в случае ризосферокомпетентного штамма Т-22 – обеспечивала защиту тех органов растений, которые как во времени, так и в пространстве, были удалены от места введения биоконтрольного агента.

В полевых испытаниях на томатах показано, что инфекция листьев, вызываемая Alternaria solani, подавлялась на 100 дней раньше в случае колонизации корней штаммом Т-22. Все еще неизвестно, как долго сохраняется СРР в отсутствие индуцирующего штамма Trichoderma. Однако известно, что если ризосферокомпетентный штамм развивается вместе с растением, то эффект СРР может сохраняться в течение длительного времени.

Так, данные показывают, что индуцированная локальная и системная резистентность является важным компонентом биоконтроля заболеваний растений штаммами Trichoderma. Однако у разных штаммов биоконтрольная активность может определяться различными механизмами, растениями и патогенами. Например, точковая мутация у T. atroviride P1 приводила к отсутствию активности эндохитиназы, что снижало эффективность биоконтроля против B. cinerea при нанесении конидий Р1 на листья, что свидетельствовало о том, что микопаразитизм важен для защиты от данного патогена. Напротив, тот же мутантный штамм обладал высокой биоконтрольной активностью против R. solani, чем родительский штамм (Harman et al., 2004).
Активация ответной реакции с помощью элиситоров могла быть ценной стратегией – альтернатива для использования трансгенных растений против патогенов. Добавление ламинарина, β-1,3-глюкана к виноградным лозам индуцировало несколько генов защиты и уменьшило инфекцию B. cinerea и Plasmopara viticola (Arst, Peñalva,
2003). Phytophthora parasitica производит гликопротеид клеточной стенки (CBEL), имеет целлюлозосвязывающий домен (CBD) и вызывает защитные реакции в растении хозяина. Проникновение CBEL не в растение-хозяина также приводит к появлению защитных реакций. Экспрессия у растений хитиназ грибов, например, Chit42, которая уже увеличила противогрибковую деятельность (Limón et al., 2004), может привести к большей устойчивости к фитопатогену. Это представляет интерес для исследования эффекта добавления растениям хитиназ или глюканаз, произведенных Trichoderma с целью продления действия защитных механизмов. По данным некоторых авторов, сопротивление растений в присутствии Trichoderma сохранилось в течение долгого времени, по крайней мере, несколько месяцев. Подобный эффект мог иметь место после добавления элиситоров Trichoderma, которые являются особенно важными в защите фруктов против инфекций после сбора урожая (Benítez et al., 2004).

Биохимические элиситоры устойчивости к заболеваниям

Известно, что штаммы Trichoderma образуют 3 типа веществ, которые индуцируют резистентность растений. Это белки с ферментативной активностью или с какой-нибудь другой активностью, продукты генов Avr (антивирулентные белки), олигосахариды и низкомолекулярные вещества, которые выделяются из клеточных стенок грибов и растений в результате воздействия на них ферментов Trichoderma.

Даже до того, как было установлено, что штаммы Trichoderma способны индуцировать резистентность растений, было известно, что ксиланаза 22 kDa, которую секретируют многие виды, индуцирует синтез этилена и защитные реакции растений. Интересно, что этот небольшой белок быстро переносится в сосудистой системе растения табака при введении через разрез листового черенка. Белок индуцировал локальную резистентность и некроз, для развития СРР белок должен распространиться по всему растению.

Недавно установлено, что штамм T. virens выделял серию белков и пептидов, которые индуцировали биосинтез терпеноидных фитоалексинов и пероксидазы в растениях хлопчатника. Показано, что 6 белков и пептидов обладали элиситорной активностью. Один из них обладал кросс-иммунореактивностью к ксиланазе, индуцирующей синтез этилена в растениях, а другой размером 18 kDa в области NH2 конца был гомологичен сериновой протеиназе Fusarium sporotrichiodes (Harman et al.,2004).

Продукты Avr генов

Белковые продукты Avr генов идентифицированы у большого количества фитопатогенных грибов и бактерий. Они расоспецифичные и индуцируют гиперчувствительность или другие защитные реакции в культиварах растений, которые содержали соответствующие гены резистентности. С помощью протеомного анализа штамма Т-22 идентифицированы белки, гомологичные Avr4 и Avr9 Cladosporium fulvum. Штамм Р1 T. atroviride также образовывал подобные белки, олигосахариды и низкомолекулярные соединения. Получены мутанты Trichoderma, экспрессирующие сигнальные системы, такие, как зеленый флюоресцентный белок или глюкозоксидаза под контролем промоторов, ассоциированных с биоконтролем. Это позволило выделить и охарактеризовать биологически активные молекулы, которые освобождаются из клеточных стенок фитопатогенных грибов или из растений под воздействием гидролаз Trichoderma. Эти молекулы, образующиеся в результате многообразных взаимодействий Trichoderma с патогенными грибами и с корнями растений в природе, действуют как индукторы экспрессии антагонистического каскада генов Trichoderma и как элиситоры защитных механизмов растений (Kubicek et al., 2001).