Штаммы энтомопатогенных бактерий bacillus thuringiensis для производства биопрепаратов в Украине

Из насекомых природных популяций выделены штаммы бактерий группы Bacillus thuringiensis, высокопатогенные для листогрызущих вредителей Coleoptera и Lepidoptera. Изучена способность штаммов к продуцированию термостабильного экзотоксина, проведена оценка их технологичности. Выделенные штаммы перспективны для создания микробного биопрепарата для защиты растений от листогрызущих вредителей.

В последние годы, учитывая негативные результаты широкого применения химических инсектицидов, все большее внимание как ученых, так и практиков привлекают микробиологические методы борьбы с вредителями растений. В отличие от ядохимикатов, микробные инсектициды обладают специфически избирательным действием на насекомых-вредителей, относительно безвредны для человека и окружающей его фауны и флоры.

Бактериальные инсектициды производят во многих промышленно развитых странах мира и применяют на всех континентах земного шара (кроме Антарктиды). Они эффективны в борьбе с гусеницами и личинками чешуе-, прямо-, жестко-, перепончато- и двукрылых насекомых. Наибольший рынок сбыта бактериальных препаратов – Северная Америка (около 50 % мирового производства), затем следуют Центральная и Южная Америка, Европа и Азия.

Наибольшее применение находят бактериальные инсектициды на основе спорообразующего микроорганизма Bacillus thuringiensis – естественного обитателя биоценозов. Несмотря на то, что впервые бактерии данного вида были выделены из насекомых, последующие исследования показали их широкую распространенность в окружающей среде. Некоторые авторы сообщают о естественном обитании бактерий данного вида в почве [1], A.W. West и S.F. Petras [2, 3] – о выявлении B. thuringiensis в составе микрофлоры листьев. Работами Л.И. Бурцевой и Г.В. Калмыковой [4] показано присутствие бактерий в насекомых, подстилках скотного двора и пастбищ.

Общепризнанная схема внутривидовой идентификации B. thuringiensis была разработана в институте Пастера в 1962 г. Охарактеризовано более 50 подвидов и показано, что B. thuringiensis является политипажным видом, различные штаммы которого отличаются физиологическими и патогенными свойствами и могут быть использованы против практически важных объектов, ранее не охваченных биометодом [5]. В процессе выделения новых штаммов B. thuringiensis могут быть открыты новые возможности биологического контроля насекомых.

Патогенное действие B. thuringiensis на насекомых связано с токсинами и другими метаболитами бактерий. К настоящему времени хорошо изучены только δ- и β-токсины. Основными, определяющими энтомопатогенные свойства бактерий, являются δ-токсины – кристаллические включения белкового происхождения (Cry-белки). β-экзотоксин продуцируется только отдельными подвидами B. thuringiensis и по структуре является аналогом аденозинтрифосфорной кислоты [6]. Экзотоксин играет особую роль в патогенезе насекомых, оказывая не только летальный, но и тератогенный эффект [7], и действуя как синергист в комплексе со спорами бактерий и кристаллами δ-токсина.

Учитывая, что β-экзотоксин имеет спектр токсического действия, отличающийся от кристаллического δ-токсина, и обладает иным механизмом действия, перспективным является создание бактериальных препаратов на основе патогенов, содержащих оба токсина.

Актуальность изучения B. thuringiensis и применения этого микроорганизма в системе защиты растений от вредителей определяет научно-исследовательскую работу лаборатории микробиометода Южной опытной станции ИСХМ УААН, целью которой является выделение из насекомых природных популяций энтомопатогенных штаммов B. thuringiensis и разработка на их основе препаратов, альтернативных химическим инсектицидам.

Материалы и методы.

В работе использовали общепринятые в микробиологии и энтомологии методы. Выделение новых штаммов бактерий проводили по методике А.А. Евлаховой и О.И. Швецовой [8]. Изучение морфологических и физиолого- биохимических свойств – согласно методик А. Barjac, А. Bonnefoi [9] и О. Lysenko [10].

Энтомопатогенные свойства бактерий изучали, руководствуясь методикой А.Я. Лесковой [11]. Для отбора высокоактивных штаммов в качестве биотестов использовали личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata, Coleoptera). Обработку корма (листья картофеля) проводили споровыми культурами бактерий при титре спор 200 млн/мл [11].

Для сравнения использовали споровую культуру B. thuringiensis var. thuringiensis 98 (биоагент препарата Битоксибациллина) с высокими антифидантными свойствами. Споровые культуры получали при культивировании бактерий в дрожже-полисахаридной среде в колбах объемом 750 мл, содержащих 35 мл питательной среды, на технологических качалках при tо 28-30 оС и 220 об./мин.

В ходе исследований, наряду с оценкой энтомопатогенных свойств бактерий, проводили оценку их антифидантных свойств по проценту повреждения листовой поверхности на третьи сутки опыта.

Для определения способности штаммов продуцировать термостабильный экзотоксин как тест-насекомое использовали 72-часовые личинки комнатной мухи (Musca domestica L.)

Активность продуцируемого экзотоксина оценивали по результатам учета гибели насекомых при разной концентрации надосадочной жидкости. Для сравнения в опытах использовали надосадочную жидкость, полученную при культивировании B. thuringiensis var. thuringiensis 98, активно продуцирующих термостабильный экзотоксин.

Для определения спектра энтомопатогенного действия активных штаммов бактерий в качестве биотестов использовали личинок и гусениц листогрызущих насекомых младших возрастов. Изучение технологичности отобранных штаммов и кинетических показателей развития культуры проводили по С.К. Перту [12].

Результаты и их обсуждение.

Научными экспедициями по поиску и сбору эпизоотологического материала для выделения штаммов B. thuringiensis были охвачены практически все южные области Украины, районы Краснодарского края, Иркутской области Российской Федерации и ряд районов Молдавии. В результате собрано более двух тысяч больных и погибших насекомых, представителей отрядов Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Neuroptera, Orthoptera, Diptera и др.

По результатам микробиологи- ческого анализа насекомых выделено 839 изолятов бактерий, 147 из которых по признакам споро- и кристаллообразования были отнесены к группе B. thuringiensis. Полученные активные штаммы составляют коллекцию штаммов B. thuringiensis, часть из них входит в состав Национальной коллекции полезных почвенных микроорганизмов при Институте сельскохозяйственной микробиологии УААН.

Для отбора высокопатогенных штаммов использовали личинок колорадского жука, как широко распространенного вредителя, не восприимчивого к промышленным биопрепаратам B. thuringiensis на основе споро-кристаллического комплекса [13].

В результате анализа, 14 из всех выделенных штаммов B. thuringiensis были отнесены к высокопатогенным (табл. 1). Под действием отобранных штаммов гибель личинок достигала 95,5-100 % (в контрольном варианте с B. thuringiensis 98 – до 97,3-100 %) в течение 7-10 суток. Причем, в вариантах со штаммами B. thuringiensis 800, 888, 990 и 994 до 50 % насекомых погибало в течение 3-4-х суток. Так наиболее эффективный по исследуемым показателям следует выделить штамм 800, под действием которого в течение 4-5 суток гибель личинок достигала 100 %.

Из отобранных патогенов 9 штаммов обладали анти- фидантными свойствами. Поедаемость корма, обработанного такими штаммами в течение первых 3-х суток не превышала 5 %, что соответствовало показателю штамма B. thuringiensis 98(табл. 1).

Установлено, что штаммы, проявляющие высокую токсичность по отношению к личинкам колорадского жука, являются продуцентами термостабильного β-экзотоксина. Так в вариантах с тестируемыми штаммами, так и в варианте со штаммом B. thuringiensis 98, вылет мух из куколок отмечен не был. Действие токсина проявлялось как на стадии пупария, так и на стадии куколки, что в конечном итоге привело к 100 % гибели подопытных насекомых.